일본 이화학연구소(RIKEN)는 극세조류 ‘남조류’의 유전자 변형을 통해 대사능력이나 광응답반응을 변화시키는 실험에 성공하였다. 이에 따라 남조류의 아미노 산의 생산을 효율적으로 증가시킬 수 있게 되었다.

남조류는 광합성을 하는 세균으로 이산화탄소를 고정하는 역할을 담당하고 있다. 이산화탄소의 고정에는 광합성에서 얻어진 광 에너지를 이용하기 때문에 남조류를 통해 빛과 이산화탄소의 관계를 이용하려는 기술이 개발되고 있다. 남조류는 광에너지와 이산화탄소를 이용하여 아미노산, 당, 바이오플라스틱, 색소 등 유용한 물질을 생산하는 능력이 있어, 이 물질의 생산능력을 높이는 신기술의 개발이 필요하였다.

남조류중 Synechocystis sp. PCC 6803은 유전자 변형이 쉽고, 증식이 비교적 빠르기 때문에 세계 각국에서 활발히 연구되고 있다. Synechocystis sp. PCC 6803의 세포의 대사 등 분자 메커니즘을 해명하는 것은 기초 생물학의 진전뿐만 아니라 유용물질 생산 등 응용전개에 있어서도 매우 중요하다. 남조류에 보존되어 있는 단백질인 히스티딘인산화효소의 하나인 HiK8은 세포 내외의 변화에 따라 자기인산화되어 하류의 단백질에 시그널을 전달하는 ‘정보전달단백질’이다. 지금까지 연구를 통해 Hik8이 Synechocystis의 대사에 관여할 가능성을 밝혀내었지만, 실험을 통해 Hik8이 탄소나 질소의 대사 등과 같은 영향을 받는다는 것은 알려지지 않았다.

연구진은 유전자 변형 Synechocystis의 Hik8단백질을 증가시켜 Hik8 과잉 발현주를 제작하였다. 명조건과 암조건에 놓인 Hik8 과잉 발현주와 대조주(야생주)에 대하여 대사체 해석을 통해 세포내의 대사생산량을 조사하여 이하의 3가지를 밝혀내었다. Hik8 과잉발현주는 1) 질소의 저장원인 다당류의 글리코겐이 크게 감소 2) 명조건에서는 6종류의 아미노산 (글리신, 이소류신, 스레오닌, 프롤린, 아스파르트산, 글루탐산)의 양이 대조주에 비하여 증가, 3) 암조건에서는 아미노산의 리신이 대조주에 비하여 증가, 당대사 상류의 당인산은 감소한다.([그림 1])

다음으로 Hik8 과잉 발현에 의한 대사의 변화를 조사하기 위해, 대사의 제어 메커니즘을 통해 조사하였다. 지금까지 연구를 통해 연구그룹은 Synechocystis의 당대사의 제어인자를 동정하였다. 그 중에는 SigE 단백질은 당의 분해반응인 ‘당이화’를 촉진하는 것이라는 것이 밝혀졌다. 이에 Hik8 과잉발현주의 SigE 단백질의 양을 측정하여 1) 명조건에서 야생주보다 적다는 것, 2) 명조건에서 암조건 하로 이동시킬 때, 야생주에서 SigE 단백질이 분해되어, HiK8 과잉발현주에서는 분해되지않는다는 것을 확인하였다. ([그림 2])

이처럼 Hik8은 SigE라는 대사를 제어하는 인자의 움직임을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한 대사체해석의 다른 면역침전법이나 유전자학 해석 등을 병용하여 Hik8 과잉발현주를 조사하여, Hik8이 KaiC1이라는 생물학적주기 시계 단백질에 협조하여 대사를 제어한다는 것을 밝혀내었다. ([그림 3]) 이를 바탕으로 Hik8 과잉발현에 의해 광응답반응이 변화하여, 여러 가지 단백질과 상호작용을 통해 남조류의 대사의 변화시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

이번 연구를 통해 남조류에 대해 정보를 전달하는 Hik8 단백질을 사용하여 새로운 전사와 대사변형의 방법을 발견하였다. 다양한 종류의 아미노산이 증가시켜, 남조류의 대사변형을 진전시키는 것으로 이산화탄소를 이용하여 유용물질의 생산으로 연결되는 가능성을 시사한다. 이후, 이 Hik8과잉 발현주를 상세하게 해석하면 남조류 세포의 분자 메커니즘의 기초생물학과 유용물질 생산이라는 응용연구의 중요한 발견을 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구결과는 JST 전략적 창조연구추진사업의 일환으로 수행되었으며, 유럽의 과학잡지 ‘Environmental Microbiology’의 온라인 판(11월 18일자)에 “Alteration of cyanobacterial sugar and amino acid metabolism by overexpression hik8, encoding a KaiC-associated histidine kinase”라는 논문으로 게재되었다.

[그림 1] 대사체분석에 의한 7종류의 아미노산량의 비교
명조건 혹은 암조건(1일)에서 대조주와 Hik8 과잉발현주에서 각각 유출한 7종류 (글리신, 이소류신, 스레오닌, 프롤린, 아스파르트산, 글루탐산,리신)의 아미노산의 비교. 대조주를 100으로 대조치를 표기하였다. 어느 아미노산도 Hik8과잉 발현주에서 증가한다는 것을 알 수 있다.

[그림 2] SigE 단백질양의 비교
: 명조건, 암조건 (1일과 3일 후)의 SigE 단백질량을 단백질흡입법(Western blotting)이라는 방법으로 측정하였다. 대조주는 100으로한 상대치를 표시하였다.

[그림 3] 암조건에서 Hik8 과잉발현에 의한 변화에 의한 대사의 모식도
: 과잉발현주 해석의 결과에서 Hik8은 생물학적 주기 시계 단백질인 KaiC1과 협조하여, 당의 분해반응을 촉진한다는 것을 확인하였다. 암조건 하에서 Hik8 과잉발현에 의해 증가하는 대사산물을 붉은 글씨로, 감소하는 대사산물을 청색으로 표시하였다.

 

[출처 = KISTI 미리안 『글로벌동향브리핑』/ 2014년 12월 1일]

理化学研究所（理研）環境資源科学研究センター代謝システム研究チームの小山内崇研究員、平井優美チームリーダーらの研究グループ^※は、微細藻類「ラン藻」を遺伝子改変し、代謝能力や光応答反応を変化させることに成功しました。これにより、アミノ酸の生産を効率的に増加できることが分かりました。

 

ラン藻は植物と似た光合成を行い、光エネルギーと二酸化炭素を使い、バイオプラスチックや糖、アミノ酸、色素などの有用物質を作ることができます。ラン藻の光合成メカニズムを分子レベルで理解できれば、将来的に光と二酸化炭素を使ったものづくりにつながると期待され、有用物質の効率的な生産方法の開発が求められています。ラン藻種に保存されている情報を伝達するタンパク質「ヒスチジンキナーゼ ^[1]」の1つであるHik8は、代謝酵素の発現を制御する可能性があるとされていましたが、代謝の仕組みに対し、実際にどのような影響を与えるかは分かっていませんでした。

 

研究グループは、淡水性ラン藻「シネコシスティス^[2]」の遺伝子を改変し、細胞内のHik8タンパク質量を増加させたHik8過剰発現株を作製しました。このHik8過剰発現株の細胞内代謝産物を測定したところ、炭素の貯蔵源であるグリコーゲンが大きく減少することや、グリシン、アスパラギン酸など、光の条件に応じて７種類のアミノ酸が増加することが分かりました。次に、代謝変化の原因を調べるために、代謝の制御に重要なタンパク質「SigE^[3]」の量を測定しました。その結果、Hik8過剰発現株では対照株（野生株）と異なり、暗条件下でもSigEが分解されないことが分かりました。つまり、Hik8タンパク質によって、暗条件下でもタンパク質や転写産物の分解が抑制されるなど、光応答性が変化することが明らかになりました。

 

今回の成果は、微細藻類の転写と代謝を改変する新しい方法といえます。今後、ラン藻の分子メカニズムの理解が深まることで、アミノ酸や糖などの効率的な生産につながると期待できます。

本研究は、JST戦略的創造研究推進事業個人型研究さきがけ（藻類・水圏微生物の機能解明と制御によるバイオエネルギー創成のための基盤技術の創出）の一環として行われ、欧州の科学雑誌『Environmental Microbiology』のオンライン版（11月18日付け）に掲載されました。

 

二酸化炭素を利用したものづくりは、地球温暖化対策のみならず、枯渇が懸念される化石燃料の代替資源を創出する手段としても非常に重要です。環境、資源問題が取り返しのつかない段階に達する前に、優れた環境技術を構築しておくことは、現代社会が担うべき責務です。

 

ラン藻は、光合成を行う細菌で二酸化炭素を固定できます。二酸化炭素の固定には、光合成で得られた光エネルギーを利用することから、ラン藻を用いて、二酸化炭素と光を共に利用する技術の開発に注目が集まっています。さらにラン藻は、光エネルギーと二酸化炭素を使い、アミノ酸、糖、バイオプラスチック、色素など、有用な物質を生産する能力があり、これらの生産能力を高める新技術の開発が求められています。

 

「シネコシスティス（Synechocystis sp. PCC 6803）」は、遺伝子改変が容易であり、増殖が比較的速いことなどから世界中で広く研究されているラン藻種です。シネコシスティスの細胞の代謝など、分子メカニズムを理解することで、基礎生物学の進展のみならず、有用物質生産などの応用展開が可能になると考えられています。ラン藻種に保存されているタンパク質「ヒスチジンキナーゼ」の1つであるHik8は、細胞内外の変化に伴って自己リン酸化されて、下流のタンパク質にシグナルを伝えていく「情報伝達タンパク質」です。これまでの研究で、Hik8がシネコシスティスの代謝に関与する可能性が示唆されていましたが、実際に炭素や窒素の代謝にどのような影響を与えるかは分かっていませんでした。

 

研究グループは、遺伝子改変によりシネコシスティスのHik8タンパク質を増加させたHik8過剰発現株を作製しました。明条件と暗条件に置いたHik8過剰発現株と対照株（野生株）に対し、メタボローム解析^[4]を行って細胞内の代謝産物量を調べたところ、以下の3つのことが明らかになりました。Hik8過剰発現株は、①炭素の貯蔵源である多糖類のグリコーゲンが大きく減少すること、②明条件では6種類のアミノ酸（グリシン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸）の量が対照株に比べて優位に増加すること、③暗条件ではアミノ酸のリジンが対照株に比べて優位に増加し、糖代謝上流の糖リン酸は減少することです（図1）。

 

次に、Hik8過剰発現による代謝の変化を明らかにするため、代謝の制御メカニズムについて調べました。これまでに研究グループは、シネコシスティスの糖代謝の制御因子を同定しています。その中で、SigE タンパク質は、糖の分解反応である「糖異化」を促進する因子であることを突き止めています^注）。そこで、Hik8過剰発現株のSigE タンパク質の量を測定したところ、①明条件下では野生株よりも少ないこと、②明条件下から暗条件下に移動させた場合、野生株ではSigEタンパク質が分解されるが、Hik8過剰発現株では分解されないことが分かりました（図2）。

 

このように、Hik8は、SigEという代謝を制御する因子の働きを抑制していることが明らかになりました。さらに、メタボローム解析の他に免疫沈降法や遺伝学的解析を併用してHik8過剰発現株調べたところ、Hik8が、KaiC1という概日時計タンパク質^[5]と協調して代謝を制御していることも明らかになりました（図3）。これらのことから、Hik8過剰発現によって、光応答反応が変化し、さらにさまざまなタンパク質との相互作用を介しながら、ラン藻の代謝を変化させることが明らかになりました。

 

[원문출처 : http://www.riken.jp/pr/press/2014/20141125_1/]